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서명 : 나노-효소기술을 이용한 기능성 수산물의 한방소재화 및 실용화 기술개발 제1장 연구개발과제의 개요 = 9 제1절 연구개발의 목적 = 9 제2절 연구개발의 필요성 = 9 1. 패각류에 대한 이용현황 = 9 가. 한약소재로서 이용 = 9 나. 식품 칼슘제로서의 이용 = 9 다. 비료로 이용 = 11 라. 수 처리제 = 11 마. 생체재료로 이용 = 13 바. 기타 = 13 2. 패각류에 대한 국내·외 산업적 활용과 문제점 = 13 3. 앞으로 전망 = 14 4. 연구개발의 범위 = 15 가. 최종 목표 = 15 나. 연차별 연구개발목표와 내용 = 15 제2장 국내외 기술 개발 현황 = 17 제1절 국내·외 관련분야에 대한 기술개발 현황 = 17 제2절 연구결과가 국내·외 기술현황에서 차지하는 위치 = 20 1. 개발기술에 대한 평가 = 20 2. 원료 및 제조시설 확보방안 = 21 가. 자원조달의 특성 = 21 나. 관련법령 또는 정부의 규제 = 21 다. 패각의 활용 가능한 분야별 국내·외 시장규모 분석 및 전망 = 22 (1) 탄산칼슘의 국내시장규모 = 22 (2) 칼슘제 시장규모 = 22 (가) 건강 기능성식품의 세계시장 규모 = 22 (나) 국내 시장 규모 = 23 (3) 항염증제 시장규모 = 23 (4) Bioceramic 시장규모 = 24 제3장 연구개발 수행 내용 및 결과 = 25 제1절 연차별 이론적 실험적 접근방법 = 25 제2절 연구방법 = 35 1. 패각 가공처리 기술개발 = 35 가. 시료수집 = 35 나. 시료 처리 = 36 다. 가공분말의 제조 = 36 (1) 일반분쇄 분말 제조 = 36 (2) 초미세분말 제조 = 36 (3) 나노분말 제조 = 37 라. 패각 분말에 대한 성분분석 = 39 (1) 수분 정량 = 39 (2) 조단백질 정량 = 40 (3) 조지방 정량 = 41 (4) 조회분 정량 = 42 (5) 탄수화물 정량 = 43 (6) 무기질 정량 = 43 (7) 지방산과 지용성비타민의 정량 = 45 마. 패각 분말에 대한 물리화학적 특성분석 = 50 (1) 표면장력의 측정 = 50 (2) pH에 대한 표면장력의 변화 = 50 (3) 계면장력 측정 = 50 (4) HLB (Hydrophilic Lipophilic Balance) value = 50 (5) 유화활성 및 유화 안정성 = 50 (6) 온도 및 열 안정성 = 51 2. 패각 추출물의 생리활성물질 탐색 = 52 가. 패각추출물(Crude conchiolin)의 추출 및 정제 = 52 (1) Crude conchiolin의 추출 = 52 (2) Conchiolin 정제 = 52 (3) 단백질 정량분석 = 57 (4) 당 정량분석 = 57 (5) TLC(Thin layer chromatography) 분석 = 59 (6) SDS-PAGE(SDS- polyacrylamide gel electrophoresis) = 59 나. 패각추출물(Crude conchiolin)에 대한 생리활성분석 = 59 (1) 항산화(DPPH method) = 59 (2) 항염증실험(COX-1, COX-2 저해활성 측정) = 60 (3) NO 생성 저해능 측정 = 60 (4) 세포독성 측정(MTT assay) = 61 (5) 미백효과(Tyrosinase inhibition assay) = 61 (6) Collagenase 저해 활성 측정(주름관련 실험) = 62 (7) Linoleic acid 자동산화 억제활성 측정 = 62 (8) 항균 및 항곰팡 활성 측정 (Antimicrobial and Antifungal activity) = 62 (9) 용혈활성측정 = 63 (10) 근육수축활성 측정 = 63 (11) Raw264.7 cell에서 가공원료추출물(Crude conchiolin)의 세포독성 및 항염증 활성측정 = 63 (가) 세포배양 = 63 (나) 세포 생존율 측정 = 64 (다) NO 생성량 측정 = 64 (라) Immunoblot analysis = 64 (마) Cytokine의 측정 = 64 3. 전 임상 동물실험 = 65 가. Rat에서 가공원료추출물(crude conchiolin)의 독성측정 = 65 (1) 체중측정 = 65 (2) GOT(Glutamic oxaloacetic transaminase), GPT(Glutamic pyruvic transaminase), LDH(Lactate dehydrogenase) 및 BUN(Blood urea nitrogen) 측정 = 65 나. DNCB로 유도된 mouse의 접촉성 피부염에 미치는 영향 = 65 (1) 실험동물의 사육 = 65 (2) 귀부종 유발 및 귀두께 측정 = 65 (3) 혈액의 채취 = 66 (4) 실험동물의 희생 및 부종유발 귀의 채취 = 66 (5) Immunoglobulin 측정 = 66 (6) Cytokine 측정 = 67 4. 효소 가수 분해법을 이용한 conchiolin peptide 제조 = 67 가. 수용성콘키올린의 추출 및 정제 = 67 나. 분리 정제 및 구조분석 = 67 (1) 아미노산 분석 = 67 (2) 분자량 측정 = 68 다. 효소가수분해에 의한 펩타이드의 제조 = 69 5. 굴 패각을 이용한 수용성칼슘의 제조 = 70 6. 대량분리정제 기술개발과 응용제품의 개발 = 70 가. 저비용 고효율의 대량분리정제법 개발 = 70 나. 산업분야별 응용제품의 개발 및 평가 = 70 (1) 식품소재 = 70 (2) 화장품소재 = 70 (3) 한방제품개발 = 70 (가) 한방 피부외용제 개발 = 70 (나) 제품의 종류 = 71 (4) 내과치료처방개발 = 72 7. 생산실용화 기술개발 = 73 가. 대량생산공정기술개발 및 경제성 검토 = 73 나. 제품에 대한 시장분석 및 산업화 전략 등 마케팅 방향연구 = 73 8. 임상실험 = 73 가. 피부 임상실험 프로토콜의 개발 = 73 나. 여드름 임상실험 = 73 다. 아토피 임상실험 = 73 라. 임상실험 protocol 1 = 74 마. 임상실험 protocol 2 = 108 바. 임상실험 protocol 3 = 131 제3절. 연구결과 = 140 1. 패각가공처리 기술개발 = 140 가. 시료 채취 및 처리결과 = 140 나. 가공분말의 제조 = 140 (1) 초미세 분말에 대한 입도분석결과 = 145 (2) 나노분말에 대한 입도분석결과 = 145 다. 가공분말의 성분분석 결과 = 148 (1) 수분 정량 = 148 (2) 조단백질 정량 = 148 (3) 조지방 정량 = 148 (4) 조회분 정량 = 149 (5) 탄수화물 정량 = 150 (6) 패각과 패류(가식부)의 일반성분 비교 = 151 (7) 무기질 정량 = 152 (8) 비타민 및 지방산 정량 = 152 (9) 유기물의 구성성분 분석 = 157 2. 패각분말의 물성분석결과 = 161 가. 표면장력 측정 = 161 나. pH에 대한 표면장력의 변화 = 162 다. 계면장력 측정 = 163 라. HLB(Hydrophilic Lipophilic Balance) value = 163 마. 유화활성 및 유화 안정성 = 164 바. 온도 및 열 안정성 = 164 사. TG, DSC 열량분석 = 169 3. 패각 추출물의 생리활성물질 연구결과 = 170 가. 패각추출물의 추출 및 정제결과 = 170 (1) Conchiolin 의 추출 = 170 (가) Conchiolin 의 추출방법 = 170 (나) Conchiolin의 수득율 = 170 (라) Crude Conchiolin 에 대한 생리활성 분석 = 174 ① 단백질 저해활성(COX, DOPA) = 174 ② Linoleic acid 자동산화 억제활성 측정 = 182 ③ 항균 및 항곰팡이 활성 측정 = 183 ④ 용혈활성측정 = 187 ⑤ 근육강화활성 측정 = 188 4. 패각으로부터 Conchiolin의 최적 추출 조건 검토 = 190 가. Conchiolin 추출용 최적 Buffer의 선정 = 190 나. 0.1M Citrate buffer와 8.0M Urea buffer로부터 추출된 conchiolin의 단백질, 당 정량 분석 = 191 다. 선정된 Buffer를 이용하여 각종 패각으로부터 분리한 conchiolin의 생리활성 비교 분석 = 194 (1) 항염증 활성 측정 (Cyclooxygenase, COX inhibition assay) = 194 (2) 항산화 활성 측정 (DPPH radical scavenging assay) = 194 라. 6종류 패각으로부터 분리한 conchiolin의 분자량분석 = 199 마. Conchiolin의 분리정제 및 생리활성 연구 = 201 (1) Conchiolin의 정제 = 201 (2) 항염증 활성 측정 (Cyclooxygenase, COX inhibition assay) = 201 (3) 항산화 활성 측정 (DPPH radical scavenging assay) = 206 (4) 미백 활성 측정 (In vitro tyrosinase inhibition assay) = 206 바. 정제된 conchiolin의 TLC(Thin layer chromatography) 분석 = 209 사. 정제된 conchiolin의 SDS-PAGE (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis) = 212 5. 대량생산을 위한 Conchiolin의 수율검증 = 214 가. 굴 패각을 이용한 Conchiolin 수율검증 = 214 6. Soluble conchiolin의 구조분석 = 217 가. 굴 패각으로부터 추출한 conchiolin의 분리정제 = 217 나. 정제된 Conchiolin의 순도 확인 및 분자량 검증 = 218 다. 정제된 Conchiolin의 아미노산 분석 = 218 라. 수용성 콘키올린의 구조분석 = 221 7. 효소가수분해에 의한 펩타이드의 제조 = 222 8. 상용화된 항염증 제품과 분리한 conchiolin에 대한 활성비교 = 225 가. 항염증 활성 측정 (Cyclooxygenase, COX inhibition assay) = 225 나. 항산화 활성 측정 (DPPH radical scavenging assay) = 229 9. 전 임상 동물실험 = 230 가. Raw 264.7 cell에서 Crude conchiolin의 세포 독성 및 항염 활성 측정 = 230 나. SD Rat에서 crude conchiolin의 독성측정 = 230 (1) 체중측정 = 230 (2) GOT, GPT, LDH = 230 다. 굴 패각 유래 conchiolin 과 나노 분말이 DNCB로 유도된 mouse의 접촉성 피부염에 미치는 여향 = 239 (1) 귀 부종에 미치는 영향 = 239 (2) 혈청 IgE의 농도에 미치는 영향 = 239 (3) IL-1β의 농도에 미치는 영향 = 239 (4) IL-6의 농도에 미치는 영향 = 239 10. 굴패각을 이용한 수용성칼슘제조 = 245 1. 대량분리정제 기술개발과 응용제품의 개발 = 246 가. 대량분리공정개발 및 경제성검토 = 246 (1) 제조공정 = 246 (2) 생산공정 설계도(100톤) = 247 (3) 생산설비단가 = 248 (4) 제조원가(패각분말 10톤/일 처리기준) = 249 (5) 국내 경쟁사 제품 및 국외 경쟁사 제품과의 품질, 기술, 가격 비교 = 250 나. 응용제품개발 = 250 (1) 굴 패각 유래 conchiolin 함유 한방 아토피 및 여드름 치료용 화장품개발 = 251 (가) 화장품 베이스 원료의 개발 = 251 (나) 제품사진 = 251 (다) 제품화를 위한 아토피치료용 화장품의 처방개발 = 251 ① 아토피 스킨처방 = 252 ② 아토피 로션처방 = 253 ③ 아토피크림 = 254 ④ 여드름용 제품의 개발 = 255 (2) 굴 패각 유래 calcium 함유 성장용 청국환의 제조 = 256 (3) 제품평가 = 257 (가) 항염증 활성 평가(Cyclooxygenase-2 저해활성, NO 생성 저해능) = 257 ① Cyclooxygenase-2 저해활성평가 = 257 ② NO 생성 저해능 평가 = 262 ③ 세포독성 평가 = 262 ④ 가공분말 및 기능성 분획물에 대한 독성실험 = 267 (4) 한방피부과 아토피 처방 protocol = 269 (가) 한방아토피 입욕제 = 269 (나) 아토피 치료제의 치료 처방순서 = 269 (다) 임상사례 = 269 (5) 내과처방개발 = 271 (가) 경부임파선 처방 = 271 (나) 해열처방 = 272 12. 임상실험(여드름, 아토피) = 273 제4장. 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 = 274 제5장. 연구개발 성과 및 활용계획 = 275 제6장. 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 = 282 제7장. 참고문헌 = 311 별첨 4, 5 |